(AR) عملية لقياس الفعالية الأنزيمية enzymatic activity بشكل سريع في عينة علف صلب
يتعلق الاختراع الراهن بجهاز لقياس الفعالية الأنزيمية enzymatic activity بشكل سريع في علف صلب solid feed، يشتمل على (i) وعاء container مصمم لاحتواء عينة الاختبارtest sample، (ii) مادة مفاعلة reagent متخصصة بالأنزيم الذي يرغب قياس فعاليته، و(iii) محلول منظم لدرجة الحموضة buffer لإذابة الأنزيم enzyme. ويفضل أن يكون العلف feed علفا صلبا لم يعالج قبل القياس.
عادة تزود الأعلاف المعدة للحيوانات المزرعية husbandry animals بأنزيمات يكون دورها بشكل رئيسي تحسين سهولة هضم digestibility حصة العلف feed ration. وترش هذه الأنزيمات عادة في صورة سائل على الأعلاف، وبصفة خاصة كما هو موصوف في البراءة الأوروبية رقم 0.789.291. ويمكن أن تضاف الأنزيمات كذلك في صورة مسحوق للعلف. وهكذا تظهر مشكلتان، تتعلق الأولى بالتحقق من انتظام uniformity توزيع الأنزيمات المضافة للعلف، وتتعلق الثانية بتقدير فعالية الأنزيم (الأنزيمات) المضاف للأعلاف بشكل سريع وسهل. وأثيرت هاتان المشكلتان بصفة خاصة من قبل مصنعي العلف ومربي الحيوانات الذين يرغبون في فحص نوعية الأعلاف التي يريدون إعطاءها لحيواناتهم. وحتى الآن، يمكن قياس الفعالية الأنزيمية في المختبر، مما يستلزم قيودا بدلالة السوقيات والتأخير، وتعتبر هذه القيود عائقا حقيقيا عندما يحتاج إلى نتيجة فورية.
يحل الاختراع الراهن هاتين المشكلتين بتزويد جهاز لقياس الفعالية الأنزيمية لأي علف غني بالأنزيم enzyme-enriched feed معد لعلف الحيوان. ويتيح هذا الجهاز، الذي يعتمد قياسه على تفاعل القياس اللوني colorimetric reaction، كل من القياس النوعي للفعالية الأنزيمية لعينة الاختبار والقياس شبه الكمي لهذه العينة.
الشكل ١ : يبين عمودا column لقياس الفعالية الأنزيمية.
الشكل ٢ : يبين أنبوبا يستخدم مرة واحدة single use tube.
يمثل الشكل ١ أحد تجسيدات الاختراع في صورة جهاز لقياس الفعالية الأنزيمية،
ويمكن قراءة الوصف أدناه فيما يتعلق بالأشكال المذكورة أعلاه.
ويشتمل الجهاز موضوع الاختراع الراهن على وعاء مصمم لاحتواء عينة الاختبار،
مادة مفاعلة متخصصة بالأنزيم الذي يرغب قياس فعاليته ومحلول منظم لدرجة الحموضة لإذابة الأنزيم المذكور.
ويمكن أن يكون وعاء هذا الجهاز، بدون قصد التحديد، عبارة عن عمود (انظر الشكل
١) مكون من جزء سفلي ضيق مدرج graduated bottom part (١١) وجزء علوي على شكل قمع واسع wide funnel-shaped top part (١٢) لإدخال مواد مفاعلة مختلفة إلى العمود ولخلطها أثناء التقليب stirring. ويمكن أن يزود العمود كذلك بفتحة مانعة للتسرب ونظام إغلاق (١٣) مثل سدادة stopper مرتبطة بجسم العمود عن طريق عروة tab (١٣١). وقد يتكون الوعاء كذلك من أنبوب يستخدم مرة واحدة (انظر الشكل ٢).
وقد يصنع الوعاء من مادة تخليقية synthetic material مثل بلاستيك يستخدم مرة واحدة
ويفضل أن يشتمل الوعاء على بروز قابل للشق cleavable protuberance (١٤) عند قاعدته، يتيح تدفق الجزء السائل من محتوياته إلى الخارج. ومن المستحسن تثبيت جزء ضيق constriction (١٤١) يحتجز الأجزاء الصلبة الصغيرة جدا solid morsels من العلف على
ويعتمد قياس الفعالية الأنزيمية على تفاعل القياس اللوني وفقا لطريقة آزو Azo method. ويعتمد مبدأ تفاعل القياس اللوني وفقا لطريقة آزو على الحلمأة الأنزيمية enzymatic hydrolysis لمادة أساس مميزة لأنزيم مرتبط بحامل لون chromophobe. وينتج التفاعل أوليغمرات oligomers قابلة للذوبان تعمل على تغيير لون الوسط إلى أزرق. ويمكن قياس درجة امتصاص absorbence الوسط عند 590 نانومتر (nanometer(nm.
وتكون المواد المفاعلة المستخدمة في الجهاز عبارة عن مادة الأساس للتفاعل المحفز بالأنزيم المرتبط بحامل اللون. وهكذا، يطلق تفاعل الحلمأة الأنزيمية مادة الأساس التي تحتوي على حامل اللون.
ويشتمل الجهاز كذلك على محلول منظم لدرجة الحموضة لإذابة الأنزيمات التي رشت على العلف، وللمحافظة على الأنزيمات عند درجة حموضتها المثلى.
ويمكن الإشارة، على سبيل المثال لا الحصر، إلى جهاز لتوضيح فعالية أنزيمات الزيلاناز xylanases.
ولقياس فعالية أنزيمات الزيلاناز xylanases، تكون المادة المفاعلة المستخدمة عبارة عن " زيلان يستخلص من الشوفان مع ريمازول بريليانت بلو R Oat spelt Xylan Remazol Brilliant Blue R" أو " زيلازيم Xylazyme AX" (يباع من شركة ميغازيم Megazyme ويتكون من أرابوزيلان araboxylane يتخلص من الشوفان أو القمح المرتبط بالصباغ dye).
ويختار المحلول المنظم لدرجة الحموضة من المحاليل المنظمة لدرجة الحموضة المكونة من حمض الأسيتيك/أسيتات الصوديوم acetic acid/sodium acetate؛ هيدركلوريد الغليسين/الغليسين glycine hydrochloride/glycine؛ حمض الأكونيتيك/هيدروكسيد
الصوديوم aconitic acid/sodium hydroxide؛ حمض الفورميك/فورمات الصوديوم
formic acid/sodium formate.
ويمكن الإشارة كذلك إلى الجهاز لتوضيح فعالية أنزيمات بيتا-غلوكاناز ،β-glucanases والتي تعتمد كذلك على تفاعل القياس اللوني وفقا لطريقة آزو.
ومن بين مواد الأساس التي يمكن استخدامها، يمكن ذكر مزيج من ١ ، ٣: ١، ٤-بيتا-D-غلوكان 1. 3:1. 4-β glucan مع ريمازول بريليانت بلو Remazol Brilliant Blue R R
وبيتا-غلوكازيم beta-glucazyme مباع من شركة ميغازيم Megazyme ويتكون من بيتا-غلوكان beta-glucan متحد مع أزورين azurine.
ويختار المحلول المنظم لدرجة الحموضة من المحاليل المنظمة لدرجة الحموضة المكونة من حمض الأسيتيك/أسيتات الصوديوم acetic acid/sodium acetate؛ هيدركلوريد الغليسين/الغليسين glycine hydrocliloride/glycine؛ حمض الأكونيتيك/هيدروكسيد الصوديوم aconitic acid/sodiujn hydroxide؛ حمض الفورميك/فورمات الصوديوم formic acid/sodium fomate.
ولقياس فعالية السليلولاز cellulase، تكون مادة الأساس المستخدمة في صورة أقراص معينة الشكل من سيلازيم Cellazyme lozenges (تباع من شركة ميغازيم Megazyme). وتتكون هذه الأقراص معينة الشكل من مواد أساس أساسها سليلوز cellulose و/أو سليلوز cellulose ومركبات زيلوغلوكان xyloglucans مبلمرة بصباغ أزورين azurine.
ووفقا لأحد تجسيدات الاختراع الراهن المفضلة، تكون المادة المفاعلة في صورة صلبة.
وعلى نحو مستحسن، لتسهيل ذوبان الأنزيم، يمكن إضافة مادة خافضة للتوتر السطحي surfactant إلى مادة الأساس التي تحتوي على عامل حامل اللون. وبصفة خاصة، تختار المادة الخافضة للتوتر السطحي من كبريتات لوريل الصوديوم sodium lauryl sulphate وكبريتات دوديسيل الصوديوم sodium dodecyl sulphate.
ووفقا لتجسيد أفضل للاختراع، يجرى القياس على أربع خطوات:
إضافة 10 مل من عينة يرغب قياس فعاليتها الأنزيمية إلى الوعاء (١)-
وبالنسبة لعينة صلبة، ينبغي ملء الوعاء بالمادة الصلبة حتى علامة التدريج
إضافة المادة المفاعلة في صورة خرزة bead صلبة؛
إضافة محلول منظم لدرجة الحموضة متخصص حتى علامة التدريج ٠ ٢ مل؛
وبعد إغلاق العمود بالسدادة، يتم رج العمود بشدة عدة مرات.
ويمكن إضافة خطوة إضافية لفصل الطور السائل والطور الصلب اختياريا (عن طريق الطرد المركزي centrifugation أو الترشيح filtration)، لاستخلاص الطور السائل وقياس شدة اللون عن طريق قياس الطيف الضوئي spectrophotometry أو ببساطة عن طريق المقارنة مع مقياس لوني.
ويؤكد ظهور لون أزرق بعد فترة تفاعل تتراوح من ٤ إلى ٨ ساعات على وجود أنزيمات فتالة، وتكون شدة اللون متناسبة مع فعالية الأنزيمات الموجودة في العينة.
وتتمثل ميزة أخرى للاختراع الراهن في المقدرة على إجراء قياس شبه كمي للفعالية الأنزيمية. ويمكن استخلاص الطور السائل الملون في العمود عن طريق قطع البروز القابل للشق من العمود. ومن ثم، يمكن مقارنة شدة لونه مع منحنى معايرة كثافة ظاهرية (od).
وبالإضافة الى كون طريقة القياس سريعة فإنها بسيطة جدا، ويمكن استخدام الجهاز في أي مكان بدون الحاجة إلى معدات خاصة. فعلى سبيل المثال، يمكن للمصنع أو مربي الحيوانات إجراء قياس ضبط حالما يصنع العلف.
وسيوصف الاختراع الراهن على أكمل وجه بمساعدة الأمثلة التالية التي لا ينبغي أن تعتبر محددة للاختراع.
أجريت سلسلتان من الاختبارات على روفابيو زيلان إل سي Rovabio xylan LC (مزيج من زيلاناز xylanase و بيتا-غلوكاناز β-glucanase من بنسليوم فونيكولوسوم Penicillium funiculosum)
وعلى روفابيو زيلاناز تي آر إلى سي Rovabio xylanase TRLC (زيلاناز xylanase من ترايكوديرما رييسي Trichoderma reesei) حيث تتراوح
فعالية الزيلاناز xylanase بين ٣٥٠ و550 يو إيه إكس سي/مل uAXC/ml . ومن المعتقد أن تؤدي معالجة رش تركيب السائل على الأعلاف إلى مستوى يتراوح من 70 إلى 110 يو إيه إكس سي/كغم Uaxc/kg من العلف.
ويكون المحلول المنظم لدرجة الحموضة المستخدم عبارة عن محلول الأسيتات acetate ٥ المنظم لدرجة الحموضة للحفاظ على درجة حموضة بلغ 4.7. ويكن إجراء الرش للعلف في صورة سهلة الانسحاق pulverulent أو في صورة حبيبية granulated form.